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哈佛等解析VCP/p97/CDC48参与底物去折叠功能的结构

文章来源: BioArt       发布时间:2019-08-13

近日,哈佛大学Tom A. Rapoport课题组(共同一作为Edward Twomey和Zhejian Ji)和犹他大学Christopher Hill教授和Peter Shen教授课题组(共同一作为博士研究生Ian Cooney和博士后韩翰)同期在Science 以Article和Report形式背靠背发表了CDC48最新的结构生物学研究。这两项研究首次将作用底物纳入对CDC48复合体的结构解析中,分别解析了CDC48-Npl4-Ufd1和CDC48-Shp1复合体和底物的作用模式。这两项研究在填补既往研究空白之余,对于我们理解VCP/p97/CDC48这一在真核蛋白质稳态中发挥重要作用复合体的功能有重要意义。


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Rapoport课题组首先利用SBP标签在体外纯化出多泛素化(6-13 K48-Linked)的底物,经Streptavidin beads富集后与Npl4-Ufd1蛋白、CDC48及核苷共同孵育,生物素洗脱后经冷冻电镜解析结构。


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这一新解析的结构模型与Rapoport课题组既往结构基本类似。但有意思的是,Rapoport课题组发现Npl4在CDC48上部形成的塔装结构除了结合有正常折叠的两个Ub分子(Ub1、Ub2)外,还有一种未折叠的Ub(unUb)分子结合在Npl4的沟中,并穿过了由D1,D2组成的ATP酶环。这三个Ub分子串联经K48异肽键相连。未折叠的unUb的N端肽段穿过了整个由CDC48 D1/D2组成的核心酶环中。此外,研究人员发现Ub的去折叠和结合到CDC48这个过程并不依赖于ATP水解作用。值得一提的是,Ub分子去折叠形式极为少见,因Ub完成折叠后呈现高度稳定的β抓握样结构,且在高温等极端变性条件下仍维持折叠构象。尽管已有多种可结合Ub的结构域被解析,本研究中发现的CDC48对去折叠的Ub的识别结合作用为现有孤例。


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Rapoport课题组对这一模型更进一步解析发现:在CDC48六聚体酶中,unUb只与D1环中两个亚基结合,但在D2环中,未折叠的肽链与4个亚基的D2结合,呈楼梯样分布(依次标名为B-E)。B-D均与ATP结合,只有E呈现ADP的结合状态。D2组成的环状ATP酶起着类似“传送带”功能对多肽链进行转位,亚基A到D结合ATP,将多肽链牵拉到ATP酶底部,亚基E水解ATP为ADP完成这一过程,随机完成下一循环。Rapoport课题组用“传送带”和“楼梯”解释这一模型,认为CDC48通过水解ATP完成六个功能亚基间的转位,实现围绕底物的登楼梯样运动,以实现对未折叠底物的传送。


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Rapoport课题组解释了关键的科学问题,即为什么Cdc48 ATP酶可以作用于及其广泛同时正确折叠的蛋白质:Cdc48 ATP酶并非直接识别底物,而是结合Ub并进行Ub去折叠来启动对底物的加工。Cdc48首先对去折叠的Ub分子的N末端牵拉进入ATP酶D1/D2环内,随后去折叠Ub后共价修饰的底物接下来通过中心孔移位,完成对底物的去折叠。


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Rapoport课题组工作模型


Peter S. Shen课题组基于Shp1-CDC48复合体提出类似的模型。研究人员认为,既往缺少底物而得出的CDC48的六聚体对称模型无法解释其ATP水解酶功能,故在S.cerevisiae中利用co-IP纯化到Shp1及CDC48。Shp1与Npl4类似,含有UBX结构域,并以此与CDC48的N端互作。


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在对CDC48 D1/D2六聚体酶环的解析中,Shen课题组强调六聚体中五个亚基(A-E)是螺旋状对称, 但F亚基位置呈现变位。且六聚体组成的环状酶在底物垂直面呈20°倾斜。


在Shen课题组最终的模型里,互相依傍的AB、BC、CD、DE亚基通过结合ATP以维持稳定,ATP结合在A、B、C、D的活性位点。当D位点水解ATP为ADP后,DE亚基间作用减弱,使E过渡到F亚基态,进而再次结合ATP结合亚基A。这种模型与Rapoport提出的“楼梯”和“传送带”模型较为类似。为解释这一模型,Shen为其工作模型制作了多个Movie进行直观的解析。


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Shen课题组工作模型


这两项工作与既往工作相比,更精细地解析了CDC48水解酶组成复合体的结构,并对这一复杂分子机器的作用模式提出了更为直观的解释。这两项工作解决了既往在VCP/p97/CDC48研究中一直较为困惑的底物识别问题,并对其水解ATP的具体过程完成较精细的解析。此外,这两项研究又进一步拓展了AAA类家族水解酶的结构学研究,为理解这一家族功能酶提供了很好的模例。


这一结构开启人们理解Cdc48/p97这个蛋白如何解折叠那些失活或者错误折叠的底物蛋白的大门,未来的研究将聚焦于Cdc48/p97如何和不同的衔接蛋白合作去参与细胞中不同的生物学过程。同时,鉴于Cdc48/p97的基因突变和多种疾病相关,这一结构有助于理解Cdc48/p97上的基因突变是如何改变这一蛋白的功能从而引发多种疾病,并会推动针对这个蛋白靶点更有效药物的研发。


研究背景


CDC48 ATP水解酶,及其在哺乳动物中的同源基因VCP/p97(Valosin-Containing Protein)蛋白是真核细胞内一类重要的AAA(ATPases associated with diverse cellular activities)类水解酶,主要参与内质网相关的蛋白质降解途径ERAD(Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation)等蛋白质稳态过程。当错误折叠蛋白或多泛素化修饰蛋白位于细胞器膜结构或聚集体中时,无法直接通过泛素-蛋白酶体途径完成降解。VCP/p97/CDC48 ATP水解酶可以将这一类蛋白分离出来,并去折叠,使底物易于进入蛋白酶体完成降解过程。Cdc48/p97的基因突变和多种疾病相关,包括多系统蛋白病(multisystem proteinopathy),家族性肌萎缩侧索硬化症(familial amyotrophic lateral sclerosis),腓骨肌萎缩症2Y型(Charcot-Marie-Tooth disease type 2Y)。此外,Cdc48/p97还是重要的癌症治疗的靶标。


关于VCP/p97/CDC48水解酶已有较多的结构生物学研究。最早在2000年Mol Cell就报道p97的基本结构:p97主要含有三个结构域:未知的N端结构域,以及含有ATP水活性的D1和D2结构域。VCP/p97/CDC48以六聚体形式组成完整的水解酶,由D1和D2两个结构域分别与其他单体酶以尾尾相连(tail-to-tail)组成六聚体,形成类似棘轮样功能结构(见后文图)。该棘轮样结构以6个D1和6个D2组成两个环状功能酶组成。2008年Structure发表了进一步优化的D2结构,发现在ATP发生水解过程中D2结构域会有较大的构象改变。2016年,Sriram Subramaniam发表在Science的研究发布了迄今为止p97最精细的冷冻电镜结构,并解析了D1/D2两个结构域分别与ADP/ATP结合三种构象,证实只有D1/D2同时结合ATP时才会发生类似齿轮样的变构作用。


随着p97全长蛋白结构的解析,部分研究更关注由其组成的分子机器的结构。p97-Ufd1-Npl4是从酵母到哺乳动物内都十分经典的功能复合体,其通过Ufd1-Npl4识别多聚泛素化蛋白,p97水解ATP将多聚泛素化蛋白从内质网等膜组分或者复合体中分离出来。Steve Matthews最早解析了p97-Ufd1-Npl4基本互作结构。随后Tom A. Rapoport课题组在去年发表在Nature Structural & Molecular Biology的研究精确解析了这一结构,发现Npl4通过UBX样结构与CDC48的N端结构互作,而Npl4的MPN结构域定位于CDC48 D1环上方,类似于蛋白酶体中Rpn11的定位。


尽管关于VCP/p97/CDC48这一关键的分子机器已有大量结构生物学数据,但对其如何真实结合底物并完成底物的去折叠功能仍缺少直接的关键结构生物学证据。此外,现有模型仍无法解释VCP/p97/CDC48这一有限的功能复合体如何实现对不同种的底物的识别和去折叠。


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